Pruebas bioquimicas

Pruebas bioquímicas

Las pruebas bioquímicas son usadas para determinar el género de la mayoria de las bacterias.

1. Tinción de GRAM.
2. Prueba de catalasa.
3. Prueba de oxidasa.
4. Prueba de oxidación/fermentación conocida como OF.
5. Motilidad.
6. Catalasa
7. Indol
8. Catalasa

Nota: Para identificar el género de las Enterobacterias se usan otras pruebas bioquimicas llamadas IMVIC que se compone de cuatro pruebas: Indol, Rojo de Metilo, Voges-Proskauer y Citrato.

Tincion gram

Fue creada en 1884 por el médico danes Hans Christian Gram, Esta tinción nos permite separar a la mayoría de las bacterias en dos grupos las gram positivas que se tiñen de color violeta y las gram negativas que se tiñe de color rosa. La diferencia en la tinción radica en las estructuras de la pared celular de las bacterias.

Pared celular de las bacterias Gram positivas.

Se observa la capa gruesa de peptidoglicano y la ausencia de lipopolisacaridos.Pared celular de las bacterias Gram negativas.

Se puede observar el entrecruzamiento de los ácidos teicoicos.

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Pared celular de bacterias Gram negativas.

Se observa el lipopolisacarido, y la poca cantidad de peptidoglicano.

Se observa bajo con tenido de péptido glicano y alto contenido de lipidos en forma de lipopolisacaridos.

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Reactivos usados en la tinción de Gram.

–Agua estéril para realizar el frotis.
–Cristal violeta también conocido como violeta de genciana.
–Safranina.
–Una mezcla de alcohol-acetona
–Agua corriente para enjuagar.

Técnica de la tinción de Gram.

De preferencia la tinción debe ser realizada sobre un recipiente para que los desechos sean desechados adecuadamente.

Frotis bacteriano.

–Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriológica hasta el rojo vivo y esperar a que enfríe un poco.
–Tomar con el asa una gota de agua estéril y agregarla en un portaobjetos.
–Flamear nuevamente el asa  y esperar a que enfríe.
–Tomar con el asa un poco de muestra bacteriana a partir de una colonia aislada.
–Después agregar la muestra en la gota de agua que esta en el portaobjetos y homogeneizar suavemente con movimientos circulares.
–Esperar que seque al aire libre o poner durante uno o dos segundos con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (sólo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfología celular de las bacterias a observar.

Tinción.

1–Agregar cristal violeta, solo el suficiente para que se cubra el extendido bacteriano.
dejar actuar durante 60 segundos.
2–Agregar el lugol, solo el suficiente, dejar actuar durante 60 segundos.
3–Enjuagar con agua corriente.
4–Agregar una o dos gotas de alcohol-acetona e inmediatamente enjuagar con agua corriente.
5–Agrgar Safranina, solo la suficiente, Dejar actuar durante 60 segundos.
6–Enjuagar con agua corriente.
7–Dejar secar a temperatura ambiente.
8–Observar en un microscopio óptico con un objetivo 100X usando aceite de inmersión.

Resumen de los pasos de la tinción de Gram.

Bacilos Gram positivos

Bacilos Gram negativos

Prueba de oxidosa

Esta prueba esta basada en la identificación de una enzima bacteriana llamada citocromoC oxidasa y para reducir el nombre se le dice oxidasa.

Todas las bacterias aerobias obtienen su energía en forma de ATP a partir del proceso de respiración también llamado cadena respiratoria, este se lleva a cabo en la membrana celular bacteriana, en las siguientes lineas se dara una breve explicación de la cadena respiratoria solo con la finalidad de entender de donde proviene y que realiza la enzima citocromoC oxidasa, entiendase que todo este proceso tiene la finalidad de producir ATP. En la respiración hay una secuencia de enzimas y transportadores que pasan los electrones desde sus sustratos hasta llegar  al citocromoC, la enzima llamada citocromoC oxidasa le quita electrones al citocromoC, estos electrones son transferidos por la enzima al oxígeno siendo este el último aceptor de electrones en la cadena respiratoria, finalmente debido a que el oxígeno tiene un exceso de electrones puede atraer átomos de Hidrógeno formando dos posibles productos: Agua o peróxido de hidrógeno.

Como realizar la prueba de la oxidasa.

• Se toma con un palillo grueso de madera una muestra bacteriana a partir de una colonia aislada proveniente de un cultivo de 24h.
• La muestra se pone en contacto con la tira o disco impregnado.
• Se debe observar una coloración morada en un lapso no mayor a 30segundos para que sea positivo, de lo contrario el resultado es negativo.

Control positivo: Pseudomonas aeruginosa.   Control negativo: Escherichia coli.        

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El color azul-morado en el disco se interpreta como oxidasa positiva.

La carencia de color en el disco se interpreta como oxidasa negativa.

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Factores a considrerar en  la pueba de oxidasa.

• No considerar un resultado positivo después de 30seg  ya que el oxigeno molecular del ambiente oxida al reactivo.
• No usar asa bacteriológica metálica ya que la mayoría de estas con tienen hierro y este es capaz de oxidar el reactivo dando nos falsos positivos.

CATALASA:

Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra ella mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros:

•Streptococcus(-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus(+).

•Bacillus (+) de Clostridium (-).

•Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C .pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de  Erysipelothrix  (-)

Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacersesiguiendo dos técnicas:1.

1.       Método del portaobjetos (recomendado):

•Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio.

•Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre elmicroorganismo sin mezclarlo con el cultivo.

•Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).

•Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.

•Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el aguaoxigenada) pueden producirse falsos positivos.2.

2.       Método del tubo de ensayo:

•Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar enslant densamente inoculado.

·         Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).

Precauciones:

Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la precaución de no retirar algo de agar con el asa alretirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dará un falso resultado positivo.

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INDOL:

Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo bacteriano. Dicha liberación se debe a la degradación del aminoácidotriptófano mediante el enzima triptofanasa.Para la realización de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas enun caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta abundantetriptófano). Para la posterior detección del indol se usa el reactivo de Kovacsque se puede preparar con los siguientes ingredientes:

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Alcohol amílico o isoamílico (puede sustituirse por alc.butílico)........150ml

•p-dimetilamino-benzaldehído..........................................................10g

•HCl (concentrado).........................................................................50ml

Se disuelve primero el aldehído en el alcohol y después se agrega lentamentea esta mezcla el ácido. Para el control de calidad del reactivo se puedenutilizar cultivos conocidos. Las más convenientes son Escherichia coli (indol+) y todas las especies de  Klebsiella (indol-).

Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al añadir al medio 5 gotas delreactivo de Kovacs, se producirá un anillo de color rojo en la superficie delcaldo y la prueba será considerada positiva. Si esto ocurre después de 24horas, la prueba se considera completa, pero si es negativo deberá incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba. Por ello es conveniente hacer siempre la prueba no en el tubo incubado sino en una porción de unos 2ml que se retirade él asépticamente

CITRATO:

Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citratocomo única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuentede nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio.Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros:

 Enterobacter, Klebsiella, Serratia,Citrobacter y algunas especies deSalmonella. Sin embargo,Escherichia,Shigella,Salmonella typhiy Salmonella paratyphison incapaces de crecer con esos nutrientes.Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este mediocontiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y denitrógeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Sólolas bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en estemedio y liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato(ácido), generará una fuerte basificación del medio que será aparente por uncambio de color del indicador de pH, de verde a azul. El cambio de color al medio azul indica una reaccion positiva.

Rojo de Metileno:(caldo MRVP) se inocula el medio con un cultivo puro joven se incuba a 35-37ºC durante 48 hr, luego determinando el tiempo de incubación se añaden 5 gotas del reactivo de rojo de metileno (no agitar).

Fermentación butilenglicoloca: en esta parte del piruvato se metaboliza produciendo cantidades menores de ácido  láctico, fórmico y acético la mayor parte del pruvato se condensa formando acetil metilcarbinol, que es reducido a 2,3 butilenglicol, productos que son neutros.

Para determinar la presencia de los productos neutros (prueba de vogues Proskaver); se agrega un

poco de A-naftol al 5% en etanol (medio que adquiere aspecto lechoso), luego se le añade KOH 40% que desaparece el aspecto lechoso, se agita fuertemente (prueba positiva color rosado-violáceo en la parte superior del tubo; Prueba negativa no tiene coloración.