Técnicas de tinción

Técnicas de tinción La tinción es una técnica que utiliza colorantes para aumentar el contraste entre los microorganismos y el medio que los rodea. Se utiliza para diferenciar los tipos de células, los constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, núcleo, mitocondria, etc.

Generalmente se realiza la fijación del microorganismo antes de su coloración para evitar cambios estructurales en el protoplasma. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las células; la tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan mayores que lo que realmente son de manera que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión.

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos son moléculas cargadas positivamente y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otros colorantes son sustancias liposolubles; este grupo se combina con los materiales lipídicos de la célula, usándose para revelar la localización de depósitos de grasa. Ejemplo el negro Sudán.

Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el ácido tánìco. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que el colorante pueda actuar. Los métodos de tinción deben usarse siempre con precaución, ya que pueden conducir a errores. Las moléculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante.

Tinción Simple

Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma

(Tinción de Ziehl-Neelsen).

TINCION DE Ziehl Neelsen

La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, para la identificación de microorganismos patógenos, por ejemplo M. tuberculosis.
Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes, Franz Ziehl (1859 a 1926), un bacteriólogo y Friedrich Neelsen (1854 -1894), un patólogo.

Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias. Contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistente. Las mico bacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.

Se ha desarrollado una coloración de ácido-alcohol resistencia modificada que diferencia las especies de Nocardia (bacterias ramificadas filamentosas cuyas paredes celulares contienen ácidos-grasos de unos 50 átomos de carbono), de los actinomiceos (muy semejantes pero no ácido-alcohol resistentes). Nocardia spp son decoloradas por la mezcla ácido-alcohol estándar pero no por un tratamiento más suave con ácido sulfúrico 0,5 a 1%. Estos microorganismos se denominan ácido-alcohol resistentes parciales o débiles.
El frotis se tiñe durante unos 5 min. con Carbol fucsina aplicando calor suave. Lavar con agua. Decolorar con alcohol etílico 95% con un 3% de ClH concentrado. Lavar y teñir durante 30-60 seg. Con Azul de Metileno (color de contraste). Lavar y secar




TECNICA:

Cubrir la lamina previa fijación de la preparación por calor con la fucsina fenicada de Ziehl Neelsen y calentarla hasta que emita vapores, sin que hierva, durante tres a cinco minutos, respondiendo constantemente el colorante para evitar la desecación.
Lavar con agua corriente.
Decolorar con el alcohol-ácido hasta que no haya más salida de color.
Lavar con agua corriente.
Contrateñir con la solución de azul de metileno por un minuto.
Lavar con agua, secar al aire y observar por inmersión.
Puede utilizarse en lugar de la Carbo fucsina de Ziehl – Neelsen la de Kinyoun, en cuyo caso no es necesario el calentamiento.

Tinción de Gram

TINCION DE GRAM

La tinción de gram o coloración de gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose gram positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y bacteria gram negativa a las que se visualizan de color rosa.

Técnica :

Preparar el frotis y fijarlo al calor
Colocar la preparación fijada con la solución de cristal violeta durante l’
Lavar con solución yodada (Lugol )
Cubrir el frotis con Lugol durante 1’
Escurrir y decolorar por alcohol hasta que no arrastre más cristal violeta.
Lavar con agua
Contrastar con la solución de fucsina por 1’
Lavar con agua, secar al aire y examinar con objetivo de inmersión

Tincion Negativa
La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de partículas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas. 

. Tinción ácido – alcohol resistencia
Esta tinción sirve principalmente para clasificar micobacterias y actinomicetos, que 
tienen un alto contenido en lípidos y en ácidos micólicos y que no pueden ser 
calificadas por la tinción de Gram. Para empezar se hecha sobre el portaobjetos una 
mezcla de fucsina – fenol, en la que la fucsina hace de colorante rosa y el fenol de 
mordiente. Las células se tiñen de rosa, tanto las ácido – alcohol sensibles como las 
resistentes. Después se usa un decolorante orgánico que hace que las bacterias 
ácido – alcohol sensibles se decoloren mientras que las ácido – alcohol resistentes 
se quedan rosa. Como en la tinción de Gram se utiliza un colorante de contraste 
que en este caso es el azul de metileno que tiñe las células ácido – alcohol 
sensibles de color azul quedando las células ácido – alcohol resistentes de color 
rosa.

Tinción de esporas
Se utiliza para teñir las estructuras de resistencia llamadas endosporas bacterianas. 
Sobre el portaobjetos con la preparación se echa verde malaquita que tiñe las 
células de verde. Luego se lava con agua destilada con lo que las células se quedan 
incoloras y las endosporas permanecen verde. Finalmente se usa la safranina para 
obtener bacterias de color rosa mientras que las endosporas continúan con su color 

verde del verde malaquita. 

Mas referencias:http://nancy-calderon.blogspot.mx/

http://datateca.unad.edu.co/.../leccin_29_tcnicas_de... 

        http://acuanatura.galeon.com/cursosonline/tecnicasdetincion/tecnicasdetincion.pdf