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jueves, 9 de octubre de 2014

Práctica 1. Envoltura de material y Esterilización.

https://drive.google.com/file/d/0BxVFe0APffUOcklkWWxjU0VoMmM/view?usp=sharing

Pruebas bioquimicas

Pruebas bioquímicas
Las pruebas bioquímicas son usadas para determinar el género de la mayoria de las bacterias.
  1. Tinción de GRAM.
  2. Prueba de catalasa.
  3. Prueba de oxidasa.
  4. Prueba de oxidación/fermentación conocida como OF.
  5. Motilidad.
  6. Catalasa
  7. Indol
  8. Catalasa
Nota: Para identificar el género de las Enterobacterias se usan otras pruebas bioquimicas llamadas IMVIC que se compone de cuatro pruebas: Indol, Rojo de Metilo, Voges-Proskauer y Citrato.

Tincion gram
Fue creada en 1884 por el médico danes Hans Christian Gram, Esta tinción nos permite separar a la mayoría de las bacterias en dos grupos las gram positivas que se tiñen de color violeta y las gram negativas que se tiñe de color rosa. La diferencia en la tinción radica en las estructuras de la pared celular de las bacterias.
Pared celular de las bacterias Gram positivas.

Se observa la capa gruesa de peptidoglicano y la ausencia de lipopolisacaridos.Pared celular de las bacterias Gram negativas.
Se puede observar el entrecruzamiento de los ácidos teicoicos.


Pared celular de bacterias Gram negativas.
Se observa el lipopolisacarido, y la poca cantidad de peptidoglicano.
Se observa bajo con tenido de péptido glicano y alto contenido de lipidos en forma de lipopolisacaridos.




Reactivos usados en la tinción de Gram.
–Agua estéril para realizar el frotis.
–Cristal violeta también conocido como violeta de genciana.
–Safranina.
–Una mezcla de alcohol-acetona
–Agua corriente para enjuagar.
Técnica de la tinción de Gram.
De preferencia la tinción debe ser realizada sobre un recipiente para que los desechos sean desechados adecuadamente.
Frotis bacteriano.
–Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriológica hasta el rojo vivo y esperar a que enfríe un poco.
–Tomar con el asa una gota de agua estéril y agregarla en un portaobjetos.
–Flamear nuevamente el asa  y esperar a que enfríe.
–Tomar con el asa un poco de muestra bacteriana a partir de una colonia aislada.
–Después agregar la muestra en la gota de agua que esta en el portaobjetos y homogeneizar suavemente con movimientos circulares.
–Esperar que seque al aire libre o poner durante uno o dos segundos con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (sólo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfología celular de las bacterias a observar.
Tinción.
1–Agregar cristal violeta, solo el suficiente para que se cubra el extendido bacteriano.
dejar actuar durante 60 segundos.
2–Agregar el lugol, solo el suficiente, dejar actuar durante 60 segundos.
3–Enjuagar con agua corriente.
4–Agregar una o dos gotas de alcohol-acetona e inmediatamente enjuagar con agua corriente.
5–Agrgar Safranina, solo la suficiente, Dejar actuar durante 60 segundos.
6–Enjuagar con agua corriente.
7–Dejar secar a temperatura ambiente.
8–Observar en un microscopio óptico con un objetivo 100X usando aceite de inmersión.



Resumen de los pasos de la tinción de Gram.
Bacilos Gram positivos

Bacilos Gram negativos














Prueba de oxidosa
Esta prueba esta basada en la identificación de una enzima bacteriana llamada citocromoC oxidasa y para reducir el nombre se le dice oxidasa.
Todas las bacterias aerobias obtienen su energía en forma de ATP a partir del proceso de respiración también llamado cadena respiratoria, este se lleva a cabo en la membrana celular bacteriana, en las siguientes lineas se dara una breve explicación de la cadena respiratoria solo con la finalidad de entender de donde proviene y que realiza la enzima citocromoC oxidasa, entiendase que todo este proceso tiene la finalidad de producir ATP. En la respiración hay una secuencia de enzimas y transportadores que pasan los electrones desde sus sustratos hasta llegar  al citocromoC, la enzima llamada citocromoC oxidasa le quita electrones al citocromoC, estos electrones son transferidos por la enzima al oxígeno siendo este el último aceptor de electrones en la cadena respiratoria, finalmente debido a que el oxígeno tiene un exceso de electrones puede atraer átomos de Hidrógeno formando dos posibles productos: Agua o peróxido de hidrógeno.
Como realizar la prueba de la oxidasa.
  • Se toma con un palillo grueso de madera una muestra bacteriana a partir de una colonia aislada proveniente de un cultivo de 24h.
  • La muestra se pone en contacto con la tira o disco impregnado.
  • Se debe observar una coloración morada en un lapso no mayor a 30segundos para que sea positivo, de lo contrario el resultado es negativo.
Control positivo: Pseudomonas aeruginosa.   Control negativo: Escherichia coli.        


El color azul-morado en el disco se interpreta como oxidasa positiva.

La carencia de color en el disco se interpreta como oxidasa negativa.





Factores a considrerar en  la pueba de oxidasa.
  • No considerar un resultado positivo después de 30seg  ya que el oxigeno molecular del ambiente oxida al reactivo.
  • No usar asa bacteriológica metálica ya que la mayoría de estas con tienen hierro y este es capaz de oxidar el reactivo dando nos falsos positivos.

CATALASA:
Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra ella mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros:
•Streptococcus(-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus(+).
•Bacillus (+) de Clostridium (-).
•Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C .pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de  Erysipelothrix  (-)
Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacersesiguiendo dos técnicas:1.
1.       Método del portaobjetos (recomendado):
•Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio.
•Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre elmicroorganismo sin mezclarlo con el cultivo.
•Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).
•Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.
•Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el aguaoxigenada) pueden producirse falsos positivos.2.
2.       Método del tubo de ensayo:
•Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar enslant densamente inoculado.
·         Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).
Precauciones:
Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la precaución de no retirar algo de agar con el asa alretirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dará un falso resultado positivo.
-
INDOL:
Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo bacteriano. Dicha liberación se debe a la degradación del aminoácidotriptófano mediante el enzima triptofanasa.Para la realización de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas enun caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta abundantetriptófano). Para la posterior detección del indol se usa el reactivo de Kovacsque se puede preparar con los siguientes ingredientes:
Alcohol amílico o isoamílico (puede sustituirse por alc.butílico)........150ml
•p-dimetilamino-benzaldehído..........................................................10g
•HCl (concentrado).........................................................................50ml
Se disuelve primero el aldehído en el alcohol y después se agrega lentamentea esta mezcla el ácido. Para el control de calidad del reactivo se puedenutilizar cultivos conocidos. Las más convenientes son Escherichia coli (indol+) y todas las especies de  Klebsiella (indol-).
Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al añadir al medio 5 gotas delreactivo de Kovacs, se producirá un anillo de color rojo en la superficie delcaldo y la prueba será considerada positiva. Si esto ocurre después de 24horas, la prueba se considera completa, pero si es negativo deberá incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba. Por ello es conveniente hacer siempre la prueba no en el tubo incubado sino en una porción de unos 2ml que se retirade él asépticamente

CITRATO:
Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citratocomo única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuentede nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio.Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros:

 Enterobacter, Klebsiella, Serratia,Citrobacter y algunas especies deSalmonella. Sin embargo,Escherichia,Shigella,Salmonella typhiy Salmonella paratyphison incapaces de crecer con esos nutrientes.Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este mediocontiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y denitrógeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Sólolas bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en estemedio y liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato(ácido), generará una fuerte basificación del medio que será aparente por uncambio de color del indicador de pH, de verde a azul. El cambio de color al medio azul indica una reaccion positiva.




Rojo de Metileno:(caldo MRVP) se inocula el medio con un cultivo puro joven se incuba a 35-37ºC durante 48 hr, luego determinando el tiempo de incubación se añaden 5 gotas del reactivo de rojo de metileno (no agitar).
Fermentación butilenglicoloca: en esta parte del piruvato se metaboliza produciendo cantidades menores de ácido  láctico, fórmico y acético la mayor parte del pruvato se condensa formando acetil metilcarbinol, que es reducido a 2,3 butilenglicol, productos que son neutros.

Para determinar la presencia de los productos neutros (prueba de vogues Proskaver); se agrega un
poco de A-naftol al 5% en etanol (medio que adquiere aspecto lechoso), luego se le añade KOH 40% que desaparece el aspecto lechoso, se agita fuertemente (prueba positiva color rosado-violáceo en la parte superior del tubo; Prueba negativa no tiene coloración.

miércoles, 8 de octubre de 2014

Técnicas de tinción



Técnicas de tinción La tinción es una técnica que utiliza colorantes para aumentar el contraste entre los microorganismos y el medio que los rodea. Se utiliza para diferenciar los tipos de células, los constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, núcleo, mitocondria, etc.

Generalmente se realiza la fijación del microorganismo antes de su coloración para evitar cambios estructurales en el protoplasma. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las células; la tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan mayores que lo que realmente son de manera que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión.

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos son moléculas cargadas positivamente y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otros colorantes son sustancias liposolubles; este grupo se combina con los materiales lipídicos de la célula, usándose para revelar la localización de depósitos de grasa. Ejemplo el negro Sudán.

Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el ácido tánìco. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que el colorante pueda actuar. Los métodos de tinción deben usarse siempre con precaución, ya que pueden conducir a errores. Las moléculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante.

Tinción Simple

Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma




(Tinción de Ziehl-Neelsen).

TINCION DE Ziehl Neelsen

La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, para la identificación de microorganismos patógenos, por ejemplo M. tuberculosis.
Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes, Franz Ziehl (1859 a 1926), un bacteriólogo y Friedrich Neelsen (1854 -1894), un patólogo.

Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias. Contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistente. Las mico bacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.

Se ha desarrollado una coloración de ácido-alcohol resistencia modificada que diferencia las especies de Nocardia (bacterias ramificadas filamentosas cuyas paredes celulares contienen ácidos-grasos de unos 50 átomos de carbono), de los actinomiceos (muy semejantes pero no ácido-alcohol resistentes). Nocardia spp son decoloradas por la mezcla ácido-alcohol estándar pero no por un tratamiento más suave con ácido sulfúrico 0,5 a 1%. Estos microorganismos se denominan ácido-alcohol resistentes parciales o débiles.
El frotis se tiñe durante unos 5 min. con Carbol fucsina aplicando calor suave. Lavar con agua. Decolorar con alcohol etílico 95% con un 3% de ClH concentrado. Lavar y teñir durante 30-60 seg. Con Azul de Metileno (color de contraste). Lavar y secar




TECNICA:

Cubrir la lamina previa fijación de la preparación por calor con la fucsina fenicada de Ziehl Neelsen y calentarla hasta que emita vapores, sin que hierva, durante tres a cinco minutos, respondiendo constantemente el colorante para evitar la desecación.
Lavar con agua corriente.
Decolorar con el alcohol-ácido hasta que no haya más salida de color.
Lavar con agua corriente.
Contrateñir con la solución de azul de metileno por un minuto.
Lavar con agua, secar al aire y observar por inmersión.
Puede utilizarse en lugar de la Carbo fucsina de Ziehl – Neelsen la de Kinyoun, en cuyo caso no es necesario el calentamiento.







Tinción de Gram
TINCION DE GRAM

La tinción de gram o coloración de gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose gram positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y bacteria gram negativa a las que se visualizan de color rosa.




Técnica :

Preparar el frotis y fijarlo al calor
Colocar la preparación fijada con la solución de cristal violeta durante l’
Lavar con solución yodada (Lugol )
Cubrir el frotis con Lugol durante 1’
Escurrir y decolorar por alcohol hasta que no arrastre más cristal violeta.
Lavar con agua
Contrastar con la solución de fucsina por 1’
Lavar con agua, secar al aire y examinar con objetivo de inmersión

Tincion Negativa
La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de partículas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas. 


. Tinción ácido – alcohol resistencia
Esta tinción sirve principalmente para clasificar micobacterias y actinomicetos, que 
tienen un alto contenido en lípidos y en ácidos micólicos y que no pueden ser 
calificadas por la tinción de Gram. Para empezar se hecha sobre el portaobjetos una 
mezcla de fucsina – fenol, en la que la fucsina hace de colorante rosa y el fenol de 
mordiente. Las células se tiñen de rosa, tanto las ácido – alcohol sensibles como las 
resistentes. Después se usa un decolorante orgánico que hace que las bacterias 
ácido – alcohol sensibles se decoloren mientras que las ácido – alcohol resistentes 
se quedan rosa. Como en la tinción de Gram se utiliza un colorante de contraste 
que en este caso es el azul de metileno que tiñe las células ácido – alcohol 
sensibles de color azul quedando las células ácido – alcohol resistentes de color 
rosa.

Tinción de esporas
Se utiliza para teñir las estructuras de resistencia llamadas endosporas bacterianas. 
Sobre el portaobjetos con la preparación se echa verde malaquita que tiñe las 
células de verde. Luego se lava con agua destilada con lo que las células se quedan 
incoloras y las endosporas permanecen verde. Finalmente se usa la safranina para 
obtener bacterias de color rosa mientras que las endosporas continúan con su color 

verde del verde malaquita. 




        http://acuanatura.galeon.com/cursosonline/tecnicasdetincion/tecnicasdetincion.pdf

Respiracion Bacteriana

Las bacterias se pueden clasificar en: anaerobias y aerobias. 
Las bacterias se pueden clasificar en:
 Anaerobias y aerobias. 
Las bacterias aerobias realizan la respiración a partir del O2 que se difunde atraves de su membrana celular. Este se utiliza directamente en el citoplasma para la respiración ya que carecen de mitocondrias. Es un conjunto de reacciones en las cuales el ácido pirúvico producido por glucólisis se desdobla a bióxido de carbono y agua, y se producen grandes cantidades de ATP. Utiliza la glucosa como combustible y el oxígeno como aceptor final de electrones. Se distinguen cuatro etapas en la respiración aerobia:
Se distinguen cuatro etapas en la respiración aerobia:
1. Glucólisis.
2. Formación de acetil coenzima A.
3. Ciclo de Krebs o ciclo del ácido cítrico.
4. Cadena respiratoria.


Tipos de organismos aerobios
·      Aerobios Obligados: Estos requieren oxígeno para la respiración celular aerobia. Utilizan el oxígeno para oxidar sustratos (tales como grasas y azúcares) para obtener energía.
·      Anaerobios Facultativos: Pueden emplear oxígeno pero también tienen la capacidad de producir energía por medios anaeróbicos.
·      Microaerófilos: Emplean oxígeno pero en cantidades muy bajas.
·      Aerotolerantes: Pueden sobrevivir en presencia de oxígeno pero no lo emplean ya que son anaeróbicos.
Ejemplos de bacterias aerobias
·      Bacilos
·      Mycobacterium tuberculosis
·      Nocardia
·      Lactobacillus
·      Pseudomonas
·      Staphylococcus (facultativo)
·      Especies de Enterobacteriaceae (facultativas)

Durante el proceso respiratorio, parte de la energía contenida en la glucosa pasa a las moléculas de ATP. Con esta energía se alimentan, excretan los desechos, se reproducen y realizan todas las funciones que les permiten vivir. Tanto el dióxido de carbono como el agua salen de la célula y del cuerpo del ser vivo (Si se trata de un organismo pluricelular) por que constituyen sustancias de desecho. La energía puede utilizarse de inmediato o almacenarse para su uso posterior.

Las bacterias no tienen mitocondrias, por lo cual la respiración se efectúa en sucitoplasma. En el resto de los organismos pertenecientes a los 4 reinos (Protistas, hongos, plantas y animales) si existen estos organelos. Algunas células tienen más mitocondrias que otras; por ejemplo, las neuronas, las células musculares y los espermatozoides requieren de altas cantidades de energía y por ello tienen numerosas mitocondrias. 

Las bacterias anaerobias realizan la fermentación y,en muchos casos,el oxigeno puede llegar a ser toxico para ellas. no tienen organelos especializados en el intercambio gaseoso.En los hongos es posible encontrar unicelulares, que realizan el proceso de la fermentación, hasta hallar multicelulares que tienen respiración aerobia.De los microorganismos AERÓBICOS estrictos se encuentran a los ESTRIPTOMICETOS, que son hongos microscópicos productores de antibiótico. También son aeróbicos la mayoría de los hongos filamentosos, como el PENICILLUM NOTATUM, productor de la penicilina.protozoos:La RESPIRACIÓN la realizan a través de la MEMBRANA CELULAR, la cual obtiene el O2 por DIFUSIÓN a través de dicha membrana celular y por las partículas de H2O absorbidas con el alimento. Luego se forma una VACUOLA PULSÁTIL, cuya función es expulsar el gas carbónico. Cuando la vacuola pulsátil está llena de H2O, se abre y lo libera al exterior. 
En la mayoría de los PROTOZOOS, la Respiración es AERÓBICA, es decir toman el O2 de su medio ambiente y expulsan el CO2 a través de la membrana celular, y algunos utilizan la Respiración ANAEROBICA, es decir en ausencia de O2, metabolizan ciertas sustancias de las cuales obtienen el O2.


Las bacterias anaeróbicas son organismos capaces de sobrevivir y crecer en una atmósfera con poco o nada de oxígeno. Las bacterias anaeróbicas se pueden clasificar en función de su relación con el oxígeno: obligadas, aerotolerantes o anaeróbico facultativas. Se pueden encontrar en una variedad de entornos, desde el suelo y el agua hasta los cuerpos de los seres humanos y otros animales. Muchas bacterias anaeróbicas se encuentran normalmente en el cuerpo humano, de hecho, en los intestinos de los seres humanos, las bacterias anaeróbicas superan en número a las bacterias aeróbicas en una proporción de 1.000 a 1.

  • Tipos de bacterias anaerobias :
Las especies Actinomyces
Las especies de Propionibacterium





Las especies Actinomyces son bacilos gram-positivos rectos o ligeramente curvados que puede variar de varillas cortas a varillaslargas y ramificadas. Esta bacteria anaeróbica se encuentra normalmente en la cavidad oral, en el tracto respiratorio superior y, en menor medida, en el tracto gastrointestinal. No son una especie particularmente virulenta de bacterias y, generalmente, sólo causan infección cuando hay alguna perturbación en la superficie de la cavidad oral o del tracto respiratorio superior (infección oportunista).
Especies bacteroides



Las especies bacteroides son bacilos gram-negativos que no forman esporas. Se consideran una de las bacterias anaeróbicas más importantes debido a su participación en muchos procesos infecciosos y a su resistencia a los antibióticos. Las bacteroides son las especies más comunes de bacterias anaeróbicas aisladas de infecciones de tejidos blandos y bacteremia. Las bacterias producen numerosos factores de virulencia tales como cápsulas, endotoxinas y varias enzimas que causan la destrucción de tejidos. Las especies de bacteroides son algunas de las bacterias más comunes que se encuentran en las heces humanas.
Las especies de Propionibacterium son bacilos pleomórficos gram-positivos que pueden aparecer en forma oval, de barra o garrote. Algunos pueden poseer ramificaciones o bifurcaciones. Es un grupo de bacterias anaeróbicas aerotolerantes que pueden crecer y multiplicarse en presencia de oxígeno atmosférico. Estas bacterias anaeróbicas se encuentran normalmente en la piel y se asocian con un proceso inflamatorio en el acné (Propionibacterium acnes). También pueden provocar endocarditis y bacteremia, pero generalmente se consideran un contaminante y no un patógeno.


         Referencias:
http://www.ehowenespanol.com/lista-bacterias-anaerobicas-lista_162619/
http://www.biologia.edu.ar/bacterias/nutric~2.htm
http://prezi.com/l-0opuvbhk1o/respiracion-en-bacterias-algas-protozoos-y-hongos/
http://curiosidades.batanga.com/2010/12/17/%C2%BFque-son-las-bacterias-aerobias

Idioma.